Тест-система для выявления генома вируса оспы коз методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени ("Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест")

ФГУ ВНИИЗЖ, Россия

Общие сведения:

Тест-система "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест" рассчитана на проведение 50 анализов (включая контроли).
В состав тест-системы входят следующие компоненты:
№1 готовая ПЦР-смесь, объем 0,550 см3 - 2 пробирки;
№2 фермент Taq ДНК-полимераза, объем 0,014 см3 - 1 пробирка;
№3 отрицательный контроль, объем 0,100 см3 - 1 пробирка;
№4 положительный контроль, объем 0,100 см3 - 1 пробирка.
Тест-система не содержит реагентов для выделения ДНК.
По внешнему виду компоненты тест-системы представляют собой прозрачную бесцветную жидкость.
Компоненты тест-системы расфасованы в пластиковые пробирки, соответствующего объема.
На пробирки с компонентами наклеена этикетка с указанием: краткого наименования организации-производителя, наименования компонента и его номера, объема компонента, номера серии, даты изготовления (мес, год) и срока годности (мес, год).
Тест-системы, упакованные в полиэтиленовые пакеты с замком или в пачки/коробки помещают в ящик из гофрированного картона (транспортная упаковка), которые при соблюдении условий транспортирования и хранения должны обеспечить сохранность тест-системы.
Компоновка тест-системы допускает возможность дробного использования компонентов для проведения исследований по мере поступления биологического материала.
Срок годности тест-системы 12 месяцев от даты изготовления. Запрещено использовать тест-систему по истечении срока годности.
Хранение тест-системы осуществляется в темном месте при температуре от -18С до -20С.
При нарушении целостности и укупорки пробирок, изменении цвета компонентов, наличии посторонних примесей, отсутствии этикеток, а также в случае истечения срока годности, компоненты тест-системы выбраковывают и обеззараживают кипячением в течение 15 минут с последующим уничтожением.

Принцип реакции:

Процесс обнаружения генома вируса оспы коз методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) включает выделение ДНК из биологического материала, и проведении амплификации полученной ДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени.
Особенность ПЦР-РВ - возможность регистрации результата ПЦР в процессе реакции, в каждый момент времени. Для выявления продуктов амплификации в режиме реального времени используют ДНК-зонд, помеченный флуоресцентным красителем FAM, который комплементарен специфическому участку генома вируса оспы коз. К зонду также присоединен гаситель флуоресценции. В ходе ПЦР происходит разрушение зонда, разъединение флуоресцентной метки и гасителя, что приводит к появлению свечения. Амплификатор соответствующей марки регистрирует интенсивность свечения, в результате чего исследователь может узнать о результатах реакции без необходимости проведения электрофореза.

Порядок применения:

Тест-система предназначена для выявления генома вируса оспы коз в образцах выделенной из биологического материала ДНК (соскобы кожи, сыворотка, цельная кровь, носовые смывы и др.) методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Транспортирование и хранение биоматериала для исследования.
Материалы должны доставляться в лабораторию в течение 24 часов, при температуре от 2С до 8С. Допускается хранение материала при температуре от -16С до -20С в течение 7 дней, при температуре от -68С до -72С в течение длительного времени.
Выделение ДНК из биоматериала проводят любым доступным методом.
Для сохранения нативной ДНК не рекомендуется многократное замораживание-оттаивание тестируемого материала.

Постановка полимеразной цепной реакции
Для проведения исследования на требуемое количество образцов ( в т.ч. на образцы положительного и отрицательного контролей) в отдельной пробирке объединяют готовую ПЦР смесь (пробирка №1) и фермент Taq-ДНК-полимеразу (пробирка №2). Реактивы вносят в количестве и последовательности, согласно таблице 1. Во время составления смеси ферменты следует держать на льду или на охлаждающей подставке.

Таблица 1. Состав и порядок сбора реакционной смеси

Этап	Реактив	Номер пробирки	Количество на 1 пробу (мкл)	Количество на n проб
1	готовая ПЦР-смесь	№1	20	20 х (n+1)
2	Фермент Taq-ДНК-полимераза	№2	0,25	0,25 х (n+1)

Смесь перемешивают на шейкере в течение 5-7 секунд, после чего центрифугируют в течение 3-5 секунд при 1000 об/мин. и раскапывают по 0,020 см3 в стерильные пробирки. Затем, в эти же пробирки добавляют по 0,005 см3 предварительно выделенной ДНК: соответствующих анализируемых образцов, отрицательных контрольных образцов (отрицательный контроль выделения и отрицательный контроль ПЦР (пробирка №3), поставляемый с тест-системой "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест"), а также положительных контрольных образцов (положительный контроль выделения (если имеется) и положительный контроль ПЦР (пробирка №4), поставляемый с тест-системой "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест"). Пробирки закрывают и помещают в амплификатор для проведения ПЦР в режиме реального времени с возможностью детекции сигнала красителя FAM.
Программирование амплификатора осуществляется согласно инструкции производителя амплификатора. Режим термического профиля должен соответствовать показателям, описанным в таблице 2.

Таблица 2. Режим термического профиля

Этап	Температура, С	Время, сек.	Изменение флуресценции	Количество циклов амплификации
Удержание температуры	95	600	-	1
Амплификация со считыванием	95	15	-	40
Амплификация со считыванием	60	60	FAM	40

Учёт и интерпретация результатов:

Результаты интерпретируются на основании наличия или отсутствия пересечения кривой флуоресценции с пороговой линией, что соответствует наличию или отсутствию на канале FAM значения порогового цикла амплификации (Ct) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой амплификатором.
Если реакция проводится на приборе Rotor-Gene, то после окончания реакции:
1. Нажмите в меню кнопку "Analysis"/"Анализ", выберете режим анализа "Quantitation"/"Количественный", затем выбрав "Cycling A. Yellow", нажмите кнопку "Show"/"Показать".
2. Отмените автоматический выбор Threshold/Порог.
3. В меню основного окна Quantitation analysis/Количественный анализ активируйте кнопки "Dynamic tube"/"Динамич. фон" и "Slope Correct"/"Коррек. уклона".
4. После выбранной линейной шкалы графического изображения результатов, выберете кнопку Linear scale/Линейная шкала (в нижней части окна справа).
5. В меню окна "More settings"/"Outlier Removal"/"Устранение выбросов" установите значение NTC threshold/Порог Фона - ПФ (NTC) - 10%.
6. В меню "CT Calculation"/"Вычесление СТ" выставите Threshold/Порог = 0,1 (В правой части экрана).
7. В таблице результатов (окно "Quant. Results"/"Количественные Результаты") появятся значения Ct.
В случае использования приборов других марок, следуйте инструкции по их эксплуатации, предоставленной производителем.
Если регистрируемой значение Ct меньше/равно 35, результат обнаружения генома вируса оспы коз считается положительным.
Если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения генома вируса оспы коз считается отрицательным.
Если регистрируемое значение Ct находится в пределах от 36 до 40, результат обнаружения генома вируса оспы коз считается сомнительным, и подлежит повторному исследованию. Если при проведении повторного исследования регистрируемое значение Ct меньше/равно 40, результат обнаружения генома вируса оспы коз считается положительным; если значение Ct не регистрируется, результат обнаружения генома вируса оспы коз считается отрицательным.
Результат считается достоверным только в случае, если:
- для положительного контроля ПЦР (пробирка 4), поставляемого с тест-системой "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест", амплификатором на канале FAM регистрирует значение порогового цикла амплификации - Ct меньше/равно 35;
- для отрицательного контроля ПЦР (пробирка №3), поставляемого с тест-системой "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест", амплификатором не регистрирует какого-либо значений порогового цикла на канале FAM.
Результат считается недостоверным (не подлежат учету) в случае, если:
- для образца положительного контроля ПЦР (пробирка №4), поставляемого с тест-системой "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест", регистрируется значение Ct больше 35;
- для образца отрицательного контроля ПЦР (пробирка №3), поставляемого с тест-системой "Оспа коз ПЦР РВ скрининг-тест", регистрируется какое-либо значение Ct.

Для получения более подробной информации о препарате, позвоните по одному из телефонов:

8 (495) 150-08-74.

Весь перечень и инструкции ветпрепаратов можно посмотреть в каталоге продукции на нашем сайте. В отношении цены, а также о возможности покупки Вас с удовольствием проинформируют наши менеджеры.

<< Назад в раздел

Понравился сайт? Поделись с друзьями!